ПЦР (истраживање) - примена. Шта је ПЦР техника?

ПЦР је тест који се користи у дијагнози многих болести. ПЦР метода омогућава да се покаже директно присуство бактерија у организму, а посебно његове ДНК. ПЦР се користи, између осталог, у дијагнози Лајмске болести. Шта је ПЦР техника? Шта је ПЦР у реалном времену?

Преглед садржаја:

1. ПЦР (тестирање) - шта је ПЦР техника?
2. ПЦР (истраживање) - примена методе ПЦР
3. ПЦР (истраживање) - Лајмска болест
4. ПЦР (истраживање) - резултати. Могу ли бити лажно позитивни?
5. ПЦР (истраживање) - резултати. Могу ли бити лажно негативни

ПЦР (ланчана реакција полимеразе) је основна метода која се користи у генетским и молекуларним лабораторијама. Развила га је 1983. године Кара Муллис, која је за њега 1993. године добила Нобелову награду.

Послушајте о чему се ради у техници ПЦР тестирања. Ово је материјал из циклуса СЛУШАЊЕ ДОБРА. Подкастови са саветима.

Да бисте погледали овај видео, омогућите ЈаваСцрипт и размислите о надоградњи на веб прегледач који подржава ХТМЛ5 видео

ПЦР (тестирање) - шта је ПЦР техника?

ПЦР тестирање састоји се од вишеструке амплификације (обично у 30-40 циклуса) одређеног фрагмента ДНК, нпр. Гена који кодирају протеине борелије, уз употребу ензима полимеразе.

Затим се користе посебне молекуларне боје како би ојачани фрагмент ДНК био видљив. ПЦР је, због појачавања специфичних фрагмената ДНК, ултра осетљива метода.

У ПЦР методи, фрагменти ДНК се појачавају помоћу специфичних парова прајмера за дати регион бактеријске ДНК. На пример, циљни региони у ПЦР који се користе у дијагнози Лајмске болести су гени који кодирају протеине, нпр. 16С рДНА, рецА, фла, п66, ОспА.

Биолошки материјал из којег се може извршити тест је:

• крв
• део коже од миграторног еритема
• цереброспинална течност
• синовијалне течности или из зглобне хрскавице
• урин

ПЦР (истраживање) - примена методе ПЦР

Поред дијагнозе лајмске борелиозе помоћу ПЦР методе, могуће је открити и специфичне фрагменте ДНК других микроорганизама или људи. Стога се метода ПЦР користи и у:

• дијагностика и праћење вирусних инфекција: херпес вируси (херпес, херпес зостер, Епстеин-Барр, цитомегаловирус), ХИВ, вируси хепатитиса (ХБВ и ХЦВ)
• дијагностика и праћење бактеријских инфекција, посебно оних бактерија које се не могу идентификовати путем културе, нпр. туберкулоза
• дијагностика и праћење неопластичних болести: леукемија, рак дојке, рак дебелог црева, рак плућа
• дијагноза предиспозиције за рак: рак дојке и јајника (гени БРЦА1 и БРЦА2), колоректални рак (гени АПЦ и ЦХЕК2)
• дијагностика генетских болести: хемохроматоза (ХФЕ ген), таласемија (гени ХБА1 и ХБА2), целијакија (гени ХЛА)
• тестови очинства, који откривају ДНК компатибилност детета и оца

Прочитајте и: Тестови за Лимеову болест - како изгледају и колика је цена тестова за Лимеову болест Вестерн Блот тест и Лимеова болест. Тумачење резултата испитивања Болести које се преносе крпељом: Лајмска болест, бабесиоза, бартонелоза, ТБЕ и други.

Тренутно постоје многе модификације методе ПЦР. На пример, у дијагнози лајмске борелиозе углавном се користе методе угнежђених ПЦР и ПЦР у реалном времену. Потоња је квантитативна метода и омогућава одређивање тачног броја копија ДНК борелије у тестираном биолошком материјалу.

ПЦР (истраживање) и лајмска болест

Серолошки тестови су основа за дијагнозу Лајмске болести. Међутим, постоје клиничке ситуације због којих би ови тестови могли бити лажно негативни:

• серолошки прозор, тј. почетни период инфекције у којем тело још увек не производи специфична антитела ИгМ и ИгГ против спирохета Боррелиа
• код људи са имунодефицијенцијом који не производе довољно антитела
• присуство имуних комплекса који се састоје од антигена Боррелиа спироцхетес и специфичних антитела за њих и спречавају откривање антитела серолошким методама

Ако се код пацијента сумња на симптоме лајмске болести, а резултати серолошких тестова буду негативни, може се извршити молекуларно тестирање засновано на ПЦР методи.

ДНК спирохета борелије може се открити у раној фази инфекције, јер је тада број спирохета у телесним течностима највећи.

У дијагнози лајмске борелиозе примарно се користе серолошке методе као што је ЕЛИСА, али у неким клиничким ситуацијама корисни су генетски тестови помоћу ПЦР методе.

Што је дуже време од инфекције, то је мања вероватноћа откривања бактеријске ДНК. Због тога се у неким случајевима, пре него што се изврши ПЦР тест, бактерије узгајају на посебним подлогама 1-2 недеље, а затим се врши тест.

Овај приступ се користи у случају сумње на Лајмску болест и прикупљену цереброспиналну течност. У касној фази инфекције, прикладније је извршити ЕЛИСА тест.

ПЦР метода се не сме користити у рутинској дијагнози лајмске борелиозе због недостатка стандардизације у погледу појаве сорти Боррелиа бургдорфери у Пољској.

Међутим, у случају потешкоћа у дијагнози (нарочито у раној фази болести), резултат ПЦР теста помаже у дијагностичком процесу.

Позитиван резултат теста значи да је у испитиваном материјалу откривено присуство ДНК Боррелиа бургдорфери и њених сорти, али не објашњава да ли се у телу дешава активна инфекција. Са друге стране, негативан резултат не искључује присуство бактерија у телу.

Неке лабораторије нуде тестирање на присуство борелијске ДНК у крпељу. Међутим, резултат таквог прегледа није основа за дијагнозу Лајмске болести код уједене особе.

Препоручени чланак:

ЕЛИСА тест - шта открива? Како прочитати резултате? Цена теста

ПЦР - резултати. Могу ли бити лажно позитивни?

ПЦР је ултра осетљива метода и истовремено врло осетљива на контаминацију. Због тога је веома важно у тестовима на основу ПЦР-а одабрати одговарајућу унутрашњу контролу како би се искључили лажни позитивни резултати.

Кључ је такође правилно прикупљање материјала за тестирање као и искуство и поузданост дијагностичара који врши тест.

ПЦР - резултати. Могу ли бити лажно негативни

Као и у било ком лабораторијском тесту, тако и у ПЦР методи могу се појавити лажно негативни резултати. Овде је пресудно прикупити крв за одговарајући антикоагулант, јер неки од њих, попут хепарина, могу инхибирати ПЦР реакцију.

Такође, прикупљање материјала након почетка антибиотске терапије може проузроковати смањење ефикасности ПЦР реакције и већу вероватноћу лажно негативних резултата.

Такође треба имати на уму да бактерије борелије живе врло кратко у крви и телесним течностима, јер захваљујући посебним рецепторима врло брзо продиру на „тешко доступна“ места у телу.

Због тога је, за разлику од дијагностике других микроорганизама, број спирохета борелије у биолошком материјалу мали, понекад чак и на граници детекције ПЦР методе. Ово такође може проузроковати лажни негатив.

Препоручени чланак:

Тест трансформације лимфоцита (ЛТТ)

Књижевност

1. Дунај Ј. и сар. Значај ПЦР методе у дијагнози лајмске борелиозе. Прегледајте Епидемиол. 2013, 67, 119 - 123.
2. Лабораторијска дијагностика болести које се преносе крпељима Препоруке радне групе: Национална комора лабораторијских дијагностичара, Национални институт за јавно здравље-Национални институт за хигијену, Национални саветник у области заразних болести, Одељење за инфективне болести и неуроинфекције, Медицински универзитет у Бјелостику, Пољско друштво за вирусологију, Варшава 2014.
3. Ружић-Сабљић Е. и Церар Т. Напредак у молекуларној дијагнози Лајмске болести. Стручњак вл Мол Диагн. 2017. јануар; 17 (1): 19-30.
4. Валонес М.А.А. и сар. Принципи и примена ланчане реакције полимеразе у медицинским дијагностичким пољима: преглед. Браз Ј Мицробиол. 2009 Јан-Мар; 40 (1): 1–11.

О аутору

Каролина Карабин, др мед., Молекуларни биолог, лабораторијски дијагностичар, Цамбридге Диагностицс Полска, биолог са специјализацијом из микробиологије и лабораторијски дијагностичар са преко 10 година искуства у лабораторијском раду. Дипломирао на Факултету за молекуларну медицину и члан Пољског друштва за хуману генетику, шеф истраживачких грантова у Лабораторији за молекуларну дијагностику на Одељењу за хематологију, онкологију и унутрашње болести Медицинског универзитета у Варшави. Одбранила је титулу доктора медицинских наука из области медицинске биологије на 1. медицинском факултету Медицинског универзитета у Варшави. Аутор многих научних и научно-популарних радова из области лабораторијске дијагностике, молекуларне биологије и исхране. Свакодневно, као специјалиста у пољу лабораторијске дијагностике, води основно одељење Цамбридге Диагностицс Полска и сарађује са тимом нутрициониста на ЦД-у за дијете. Своје практично знање о дијагностици и дијетотерапији болести дели са специјалистима на конференцијама, тренинзима, у часописима и на веб локацијама. Посебно је занима утицај модерног начина живота на молекуларне процесе у телу.